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          技術分享 | 細胞毒性檢測方法

          作者:佚名    發布日期:2019-04-02 09:00

           

          MTT法又稱MTT比色法,是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。在一定細胞數范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。

          常用實驗步驟:


          1.接種細胞:用含10%胎牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔合適的細胞數量接種到96孔板,每孔體積180ul;

          2.培養細胞:同一般培養條件,可根據試驗目的和要求決定培養時間;

          3.呈色:每孔加MTT溶液(5 mg/ml用PBS緩沖液pH=7.4配制)20ul。繼續孵育4小時,終止培養,小心棄去孔內培養上清液,對于懸浮細胞,需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ulDMSO,振蕩10分鐘,使結晶物充分融解。

          聯科生物MTT試劑盒提供MTT Solvent,可直接添加溶解MTT。試劑盒中還包含Formazan Solvent,使用中若是懸浮細胞,可直接在培養基中加入與初始體積等量的溶解液。

          4.比色:選擇 490nm波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果。

           

          影響實驗關鍵因素:

           

          1. 細胞消化。若消化出現問題,則會影響細胞的活性,進而影響OD值。對于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的細胞,消化時胰蛋白酶中不添加EDTA,消化時也僅需胰酶浸潤數秒即可。然而,對于SW480等一系列難以消化的細胞,胰蛋白酶中需添加濃度為0.25%的EDTA;
          2. 接種數量。對于細胞接種數量要適宜,過小或過大均會影響OD值(過小細胞容易死亡,過大細胞容易生長擁擠);
          3. 培養液的棄去。或用移液器吸取孔內培養液,吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取,不要觸碰底部的紫色結晶。或將96孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內的培養液。
          4. 結晶物的溶解。加入DMSO,放入37℃孵箱內孵育10~20 min,有助于DMSO對紫色結晶物的溶解。

          困惑:
          棄液,細胞脫落或培養液里的紫色結晶易吸去,重復性差,怎么辦?

          建議先用平板離心機離心96孔板,之后參考以下推薦方法:

          方法1:用1mL醫用的注射器加上針頭吸取液體,吸取時要把板子斜放,沿著壁吸取。

          方法2:優化操作,使用三聯溶解液:10%SDS,5%異丁醇,0.012 mol/LHCL,蒸餾水溶解。

          文獻:評價抗癌物質活性的改良MTT方法.周建軍.中國醫藥工業雜志,1993,24(10):455-457.

          方法3:使用MTSblue。MTSblue的活性成份是Resazurin,一種無毒、可透膜的藍色染料,有微弱的熒光性。聯科生物MTSblue采用單一試劑,只需加入培養基即可連續、快速地檢測細胞的增殖狀況。相比于MTT,無毒、即用、可連續檢測,值得推薦。

          方法4:使用CCK-8試劑,它利用有高度水溶性的黃色甲染料,且CCK-8試劑組分單一,無需其它組分預混等操作。相比MTT,CCK-8:

          1、操作簡便,只需一步即可得到結果;

          2、省時即開即用,無需配置其它溶液;

          3、安全,無需放射性同位素和有機溶劑;

          4、快速,省去了溶解沉淀等操作;

          5、重現性好,步驟少、損失少。

          MTSblue檢測BHK21 細胞:


          聯科生物提供不同規格MTT、MTSblue 、CCK8試劑供實驗選擇。有需求的同學,請聯系聯科生物當地銷售。

           

          產品列表:

           
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          以上文章參考丁香園

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