<output id="vanmu"><form id="vanmu"></form></output><output id="vanmu"></output>
<meter id="vanmu"></meter>
    1. <code id="vanmu"></code>
      <acronym id="vanmu"></acronym>
      1. <meter id="vanmu"></meter>
          <code id="vanmu"></code>
          歡迎來到聯科生物!
          請登錄|注冊
          全部分類
          首頁 > 生物資訊 > 技術資料 > 小鼠Th1/Th2和Tc1/Tc2的檢測

          小鼠Th1/Th2和Tc1/Tc2的檢測

          作者:聯科生物    發布日期:2018-12-13 09:00


          1.檢測原理


          小鼠 Th1/Th2 細胞及 Tc1/Tc2 細胞與人的相似,均可分泌多種細胞因子:

          Th1 細胞主要分泌 IL-2、IL-12、IFN-γ和 TNF-β等;

          Th2 細胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10


          與人相同,鑒別 Th1/Th2 及 Tc1/Tc2 同樣采用下面的組合:

          Th1:CD4+IFN-γ+,

          Th2:CD4+IL-4+

          Tc1:CD8+IFN-γ+,

          Tc2:CD8+IL-4+

          刺激素也是我們通常選用的為 PMA(佛波酯)+ Ionomycin(離子霉素)。


          與人 Th1/Th2 和 Tc1/Tc2 不同的是,小鼠淋巴細胞在 PMA 和 Ionomycin 的刺激下,其表面的 CD4 抗原下降不明顯,因此可以用 CD4 和 CD8 的抗體直接設門分析 Th1/Th2 及 Tc1/Tc2。但如果同時想得到Th1/Th2 及 Tc1/Tc2 的數據,也可采用 CD3 和 CD8 反設門法,即 CD3+CD8+代表 Tc,CD3+CD8-代表 Th,在此基礎上得到 IFN-γ和 IL-4 表達的百分率。


          2. 檢測方法


          【試劑】 

          PMA、 Ionomycin、BFA(Brefeldin A)、Monensin 和 RPMI1640 的配制與人 Th1/Th2 和 Tc1/Tc2 檢測相同,詳見第三部分的檢測方法。


          【抗體和破膜劑】

          ?  抗體

          供應商 產品名稱 貨號 亞型
          MultiSciences Anti-Mouse CD3e (145-2C11), PerCP-Cy5.5 70-AM003E07-250 Armenian Hamster IgG
          MultiSciences Anti-Mouse CD8a (53-6.7), FITC 70-AM008A01-250 Rat IgG2a, κ
          MultiSciences Anti-Mouse IFN-γ (XMG1.2), PE 70-AM0IF04-250 Rat IgG1, κ
          MultiSciences Anti-Mouse IL-4 (11B11), PE 70-AM0I404-250 Rat IgG1, κ


          ?  同型對照

          供應商 產品名稱 貨號 對應抗體
          MultiSciences Rat IgG1 Isotype Control (HPPN), PE 70-CRG104-50  IFN-γ、IL-4

           

          ?  破膜劑

          供應商 產品名稱 貨號 規格
          MultiSciences FIX&PERM Kit 70-GAS006 200T


          【抗體組合】

          ?  三色法

          管號 FITC PE PE-Cy5 注釋
          1 CD8 Rat IgG1 CD3 第 2,3 管的同型對照
          2 CD8 IFN-γ CD3 CD3+CD8- IFN-γ+為 Th1 細胞
          CD3+CD8+ IFN-γ+為 Tc1 細胞
          3 CD8 IL-4 CD3 CD3+CD8- IL-4+為 Th2 細胞
          CD3+CD8+ IL-4+為 Tc2 細胞


          【實驗步驟】 


          1.標本采集及制備


          A. 血液標本

          小鼠血液標本一般采用眼眶后靜脈叢采血法,因此法不需麻醉或處死小鼠,對小鼠的傷害小,且可重復采血,具體方法如下:

          1)穿刺采用一根特制的長 7~10cm硬的玻璃取血管,其一端內徑為 1 ~1.5m,另一端逐漸擴大,細端長約 1cm 即可,將取血管浸入 1%肝素溶液,干燥后使用;

          2)采血時,左手拇指及食指抓住鼠兩耳之間的皮膚使鼠固定,并輕輕壓迫頸部兩側,阻礙靜脈回流,使眼球充分外突,提示眼眶后靜脈叢沖血;

          3)右手持取血管,將其尖端插入內眼角與眼球之間,輕輕向眼底方向刺入,當感到有阻力時即停止刺入,旋轉取血管以切開靜脈叢,血液即流入取血管中;

          4)采血結束后,拔出取血管,放松左手,出血即停止。

          注:

          1)用本法在短期內可重復采血。小鼠一次可采血 0.2~0.3ml;

          2)為適用于 Th1/Th2 及 Tc1/Tc2 檢測,需用肝素鈉來處理取血管,不可用肝素鋰、EDTA 或枸櫞酸鈉。


          B. 脾單細胞懸液的制備

          脾單細胞懸液的制備通常有兩種方法,可依據自己的喜好及習慣來選擇。

          1) 研磨法

          ? 小鼠用 CO2 處死,立即無菌取脾;

          ? 將脾浸入裝有冷 PBS 的培養皿中,用鈍頭剪刀剪去白色的結締組織,換入另一個裝有冷 PBS的培養皿中以清洗脾臟;

          ? 再次換入一個裝有冷 PBS 的培養皿中;

          ? 用小的彎頭手術剪剪切脾臟成 3mm3 左右的小塊;

          ? 用 5ml 或 10ml 塑料一次性注射器的尾部背面輕輕按壓研磨脾臟小塊,此時會看到很多脾單細胞進入 PBS 中。對于一只 30 克左右的小鼠,完全研磨脾臟后約可獲得 100 x 106 左右的細胞;

          ? 經 200 目篩網過濾獲得單細胞懸液,用冷 PBS 洗滌 2 次,每次 1000r/min, 離心 10 分鐘;

          ? 將細胞懸浮于 RPMI 1640(含 10%熱滅活FBS)中,用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在 95%以上);

          ? 調節細胞濃度為 2 x 106 細胞/ml。

          2) 穿刺法

          ? 小鼠用 CO2 處死,立即無菌取脾;

          ? 將脾浸入裝有冷 PBS 的培養皿中,用鈍頭剪刀剪去白色的結締組織,換入另一個裝有冷 PBS的培養皿中以清洗脾臟;

          ? 用 10ml 注射器的針頭在脾臟表面密密麻麻穿刺;

          ? 用針頭吸取培養皿中的 PBS,用力注入脾臟中,細胞即會從小孔中流出;

          ? 徹底沖出脾細胞內的細胞,用玻璃吸管吸取細胞懸液;

          ? 經 200 目篩網過濾獲得單細胞懸液,用冷 PBS 洗滌 2 次,每次 1000r/min, 離心 10 分鐘;

          ? 將細胞懸浮于 RPMI 1640(含 10%熱滅活FBS)中,用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在 95%以上);

          ? 調節細胞濃度為 2 x 106 細胞/ml。


          C. 淋巴結單細胞懸液的制備

          ? 小鼠用 CO2 處死,立即無菌取出腋下和腹股溝淋巴結;

          ? 將淋巴結浸入裝有冷 PBS 的培養皿中,用鈍頭剪刀剪去脂肪組織,換入另一個裝有冷 PBS 的培養皿中以清洗脾臟;

          ? 再次換入一個裝有冷 PBS 的培養皿中;

          ? 用小的手術剪剪切淋巴結成 3-4mm 大小的小塊;

          ? 在培養皿中放置一個孔徑為 20um 的篩網,用 5ml 或 10ml 塑料一次性注射器的尾部背面輕輕按壓小塊,使得淋巴結的單細胞通過篩網進入其下面的 PBS 液中;

          ? 用冷 PBS 洗滌 2 次,每次 1000r/min, 離心 10 分鐘;

          ? 將細胞懸浮于 RPMI 1640(含 10%熱滅活FBS)中,用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在 95%以上);

          ? 調節細胞濃度為 2 x 106 細胞/ml。


          2.刺激及檢測(簡易的三色法)


          1) 全血標本:取 45ul 全血標本于試管中,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS)稀釋至 300ul;

          PBMC 標本:取 300ul PBMC(2 x 106 細胞/ml)于試管中

          2) 加入 7.5µl 1µg/ml PMA 工作液 + 6µl 50µg/ml Ionomycin 工作液 + 5.1µl 0.1mg/ml Monensin 工作液(或 6µl 0.5mg/ml BFA 工作液),混勻

          3) 37 ℃,5% CO2 培養箱培養 4~6 小時。(不能超過 6 個小時)

          4) 混勻,加入 5ul CD3e-PerCP-Cy5.5 和 5ul CD8a-FITC, 室溫,避光孵育 15 分鐘

          5) 分成 3 管,每管加入 100µl 已染色的全血, 編號為 A1,A2 和 A3

          6) 每管中加入100µl Fix&Perm中的Reagent A(即固定液),室溫,避光孵育15分鐘

          7) 每管中加入 3mL PBS,1200 rpm 離心 5 分鐘,棄除上清。(此時需用剩余的些許 PBS 輕輕震蕩來重懸細胞,以免在后面的步驟中造成重懸細胞困難)

          8) 每管中加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent B(即破膜和溶血液),同時各管中按下表加入相應的抗體:

           
          管號 A1 A2 A3
          抗體 Rat IgG1-PE IFN-γ IL-4


          9)室溫,避光孵育15分鐘。每管中加入3mL PBS,1200 rpm離心5分鐘,棄除上清

          10)0.5mL PBS 重懸細胞,上機檢測

           

          【結果分析】

          該結果得自對小鼠脾細胞的 Th1/Th2 和 Tc1/Tc2 的分析。

          如圖 3A,用 R1 區域選定脾細胞;

          如圖 3B,設門于 R1,用 R2 區域選定 CD3+T 細胞;

          如圖 3C,設門于 R1+R2,得出 Th1 和 Tc1 在 CD3+T 細胞中的比例;

          如圖 3D,設門于 R1+R2,得出 Th2 和 Tc2 在 CD3+T 細胞中的比例;

          3:小鼠 Th1/Th2 Tc1/Tc2 的流式分析方法


          ? 3. 其它相關細胞因子的檢測


          除 IFN-γ?和 IL-4 外,IL-1a、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、GM-CSF1 和 TNF-α等也是 Th1/Th2 或 Tc1/Tc2所分泌的細胞因子,雖然不是非常特異,但在某些疾病中同樣發揮著重要的作用,因此也有檢測的必要。

          檢測這些細胞因子時,要注意所用的刺激劑及刺激方法與 IFN-γ?和 IL-4 有所不同,因 PMA+Ionomycin不一定能使這些細胞因子達到最大分泌。所以需參照下表(表 10),根據不同的細胞因子,選擇最佳的刺激方法。


          表 10:小鼠 Th1/Th2、Tc1/Tc2 相關細胞因子的刺激方法

           
          細胞因子 標本類型 刺激時間 再刺激 阻斷劑
          IL-1a 小鼠 PEC 1) 小鼠 IFN-γ(100ng/ml) 2hr   Monensin
           
            小鼠 PEC 2) LPS(100ng/ml) 22hr  
          IL-2 小鼠脾臟 1) ConA(3ug/ml) 2d CD3 抗體
          (10ug/ml immobilized)
          +
          CD28 抗體
          (2ug/ml soluble)
           5hr
           

           
            小鼠脾臟 2) L-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
          IL-6 小鼠脾臟 1) ConA(3ug/ml) 2d
            小鼠脾臟 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
          IL-10 小鼠脾臟 1) ConA(3ug/ml) 2d
            小鼠脾臟 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
          IL-12 小鼠 PEC 1)小鼠 IFN-γ(100ng/ml) 2hr  
          IL-12 小鼠 PEC 2) LPS(100ng/ml) 22hr  
          GM-CSF 小鼠脾臟 1) ConA(3ug/ml) 2d CD3 抗體
          (10ug/ml immobilized)
          CD28 抗體
          (2ug/ml soluble)   5hr
          GM-CSF 小鼠脾臟 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d
          TNF-α 小鼠脾臟 1) ConA(3ug/ml) 2d
          TNF-α 小鼠脾臟 2) IL-2(20ng/ml)+IL-4(20ng/ml) 3d


          注:PEC: thioglycolate-elicited peritoneal macrophages,巰基乙醇酸鈉釋放的腹膜舉噬細胞;
          ConA :刀豆蛋白 A;
          LPS:脂多糖;
          hr:hour,小時;
          d:day,天

          今日推薦
          • 1
          • 2
          • 3
          • 4
          • 5

          總排行

          敗血癥研究之新模型
          在全球范圍內,每年有上百萬人因敗血癥而死亡,這也...[詳情]
          新型生物可吸收貼片獲得 FDA 突破性認定
          開發生物可吸收醫療器械的醫學科技公司 Polyganics 近日...[詳情]
          石墨烯超導重大突破
          2018年3月5日,國際頂尖期刊Nature連刊兩文,以背靠背長...[詳情]
          CAR-T癌癥免疫療法機制新突破
          2018年2月13日最近一項研究表明CAR-T免疫療法不僅能夠用...[詳情]
          新研究揭示自身免疫性腎病如何發生
          2018年3月1日莫納什大學的研究人員已經揭開了一個謎團...[詳情]
          罕見免疫細胞能阻止癌癥擴散
          近日,來自英屬哥倫比亞大學的研究小組發現,10年前...[詳情]
          浙大團隊刊發兩文:抑郁癥研究獲重大突破
          浙江大學醫學院和求是高等研究院胡海嵐團隊在抑郁癥...[詳情]
          PD-1抗體藥物:免疫治療領域的“當紅明星”
          新里程美家國際醫療中心指出:當人體免疫內環境出現...[詳情]
          流式TH亞群新品上線第二波
          聯科生物,專注流式產品15年…… 如果你也從聯科購買...[詳情]
          全國統一客服電話: 400-672-1600 網址:www.g9881.com 郵箱:info@liankebio.com
          版權所有:杭州聯科生物技術股份有限公司
          浙ICP備11037718號-1  浙公網安備 33010502002427號
          在線客服
          在線客服
          • 服務熱線400-6721-600
            工作時間
            8:30-17:30
          二維碼
          Powered By ShopEx
          91福利导航