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          調節性B細胞的流式檢測方案

          作者:聯科生物    發布日期:2018-12-12 09:00

          ?   背景知識簡介


          對病原體產生免疫并將其清除,通常需要 B 細胞依賴的體液免疫應答和T細胞依賴的細胞免疫應答。B 細胞可通過分泌抗原特異性的抗體以及輔助誘導CD4+T 細胞活化來正向調控免疫應答。然而近來發現 B 細胞中有一群特異性的亞群可負向調控免疫應答,稱為調節性 B 細胞,即 Breg。Breg 的缺失會加劇病癥,包括炎癥、自身免疫疾病(如接觸性超敏反應(CHS)、實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EVE)、慢性腸炎和膠原酶誘導的關節炎(CIA))、癌癥和感染疾病等[1-6]。


          Breg 的免疫應答調節機制包括:1. 分泌 IL-10 調節 Th1/Th2 平衡(1a)、直接抑制炎癥級聯反應(1b);2. 分泌 TGF-β1 誘導效應 T 細胞凋亡;3. 直接或作為二級 APC 抑制活化的 CD4+T 細胞;4. 以 β2 微球蛋白依賴的方式(MHC I 和 CD1d)招募 Treg 亞群(CD8+T 細胞和 NKT 細胞);5. 分泌 IgG 和 IgA 中和有害可溶性因子(5a)、通過 IgG/FcγRIIB 抑制 DC/巨噬細胞的活化(5b)以及增強清除含有潛在自身抗原的凋亡細胞(5c)(圖 1)。
           

          圖 1 Breg 的免疫應答調節機制[7]

          最近發現一群調節性 B 細胞的亞群,通過 IL-10 來調節 T 細胞依賴的 CHS 和EVE。該 B 細胞亞群的表型是獨一無二的 CD1dhiCD5+CD19hi[5],在野生型小鼠的脾臟中約占 1-2%。在體外經 LPS、PMA、ionomycin 和 monensin 刺激后,可誘導產生分泌免疫抑制性細胞因子 IL-10 的 CD1d hiCD5+ B 細胞,稱為 B10 細胞,以區分于其它調節性 B 細胞亞群。去除 B10 細胞可能增強某些免疫反應;增強 B10細胞功能可抑制一些自身免疫性疾病(如接觸性過敏反應)中的炎癥和過程的免疫反應。


          IL-10 對大多數造血細胞具有抗炎癥和抑制作用。IL-10 不僅可抑制 Th1 和 Th2細胞的極化[8, 9],也能抑制單核細胞和巨噬細胞分泌促炎性因子[10]。IL-10-/-小鼠會產生炎性腸炎,也會加劇 EVE、CIA 和 CHS[11]。因此 IL-10 可抑制炎癥和自身免疫應答。B10 細胞不是 IL-10 調控的唯一來源,因此在炎癥過程中需要進一步闡明 B10 和調節性 T 細胞的各自功能。


          但 IL-10 在腫瘤免疫中的作用仍有爭議。IL-10 可促進腫瘤生長,抑制免疫效應細胞的功能。然而 IL-10 可促進 CD8+T 細胞和 NK 細胞對腫瘤排斥,而且還能抑制腫瘤誘導的血管發生,并增強腫瘤毒性分子如 NO 的分泌,導致腫瘤退化。


          有學者認為調節性 B 細胞也許可以分為“先天型”(多克隆刺激誘導 IL-10 分泌)和“獲得型”(抗原特異性 IL-10 分泌)。LPS 的刺激可使 B10 分泌 IL-10;而調節性 B 細胞分泌 IL-10 也需要 CD40 的參與。


          Breg 在炎癥條件下被特異性地誘導,能夠抑制炎癥反應的加劇和/或加速恢復進程。但目前仍然有許多有關調節性 B 細胞的問題需要進一步的研究闡明。如Breg 是否具有抗原特異性?支持調節性 B 細胞和致病性 B 細胞發育的條件是什么?調節性 B 細胞是否也具有類似調節性 T 細胞的特異性轉錄標志如 FoxP3?調節性 B 細胞在某些炎癥條件下是否具有致病性?或者其僅具有調節性功能?調節性功能(分泌 IL-10、TGF-β 和二級 APC 活性)是由同一群 Breg 還是不同 Breg 亞群發揮的?Breg 活化的信號通路是什么?Breg 的存在說明具有不同的機制來調控免疫應答,其中 B10 在自身免疫疾病和炎癥反應中發揮了重要的調控作用。


          ?  流式檢測方案


          【試劑】

          一、刺激劑和阻斷劑

          PMA

          Multisciences,70-CS0001,溶于乙醇,0.1 mg/ml,100μl 包裝。-20℃保存。

          Ionomycin

          Multisciences,70-CS0002,溶于乙醇,1 mg/ml,50μl 包裝。-20℃保存。

          Monensin

          Multisciences,70-CS0004,溶于乙醇,50 mg/ml,100μl 包裝。4℃保存至少4個月。

          LPS


          二、固定破膜劑

          Fix&Perm Kit(Multisciences, 70-GAS003)


          三、Fc 受體阻斷劑

          人:Human Fc Receptor Binding Inhibitor Purified (eBioscience, 85-14-9161)

          小鼠:Anti-Mouse CD16/CD32 (2.4G2), Purified (Multisciences, 70-AM016)


          四、細胞培養液

          RPMI 1640,含 10% FCS、200 μg/ml penicillin、200 U/ml streptomycin 和 4mML-glutamine


          五、淋巴細胞分離液

          使用前恢復至室溫。


          六、B 細胞分選磁珠及檢測試劑(可選)

          人:

          CD19 MicroBeads, human (99-130-050-301),檢測抗體如 Anti-Human CD19 APC(eBioscience, 85-17-0199) 或 Anti-Human CD19 FITC (eBioscience, 85-11-0199) 或Anti-Human CD19 PE (eBioscience, 85-12-0199)等

          小鼠:

          CD19 MicroBeads, mouse (Miltenyi, 99-130-052-201),檢測抗體如 Anti-Mouse CD19 FITC (eBioscience, 85-11-0193) 或 Anti-Mouse CD19 PE (eBioscience, 85-12-0193)或Anti-Mouse CD19 APC (eBioscience, 85-17-0193)等;或 CD45R (B220) MicroBeads, mouse (Miltenyi, 99-130-049-501),檢測抗體如Anti-Human/Mouse CD45R (B220) FITC (eBioscience,85-11-0452)或Anti-Human/Mouse CD45R (B220) PE (eBioscience, 85-12-0452)或Anti-Human/Mouse CD45R (B220) APC (eBioscience, 85-17-0452)等


          七、抗體

          人:

          管號 抗體 廠商 目錄號 注釋
          1 Mouse IgG2b κ Isotype Control PE eBioscience 85-12-4732 表面染色(對應于 CD1d)
          1 Mouse IgG2a κ Isotype Control PerCP-Cy5.5 eBioscience 85-45-4724 表面染色(對應于 CD5)
          1 Rat IgG1 κ Isotype Control eFluor® 660 eBioscience 85-50-4301 胞內染色(對應于 IL-10)
          2 Anti-Human CD19 FITC eBioscience 85-11-0199 表面染色
          2 Anti-Human CD1d PE eBioscience 85-12-0016 表面染色
          2 Anti-Human CD5 PerCP-Cy5.5 eBioscience 85-45-0058 表面染色
          2 Anti-Human IL-10 eFluor® 660 eBioscience 85-50-7108 胞內染色


          小鼠:

          管號 抗體 廠商 目錄號 注釋
          1 Rat IgG2b κ Isotype Control PE eBioscience 85-12-4031 表面染色(對應于 CD1d)
          1 Rat IgG2a κ Isotype Control PerCP-Cy5.5 eBioscience 85-45-4321 表面染色(對應于 CD5)
          1 Rat IgG2b κ Isotype Control APC eBioscience 85-17-4031 胞內染色(對應于 IL-10)
          2 Anti-Mouse CD19 FITC eBioscience 85-11-0193 表面染色
          2 Anti-Mouse CD1d PE eBioscience 85-12-0011 表面染色
          2 Anti-Mouse CD5 PerCP-Cy5.5 eBioscience 85-45-0051 表面染色
          2 Anti-Mouse IL-10 APC eBioscience 85-17-7101 胞內染色


          八、流式染色緩沖液

          Flow cytometry Staining Buffer (MultiSciences, 70-S1001)

          【實驗步驟】
          一、試劑準備

          1. PMA (Multisciences, 70-CS0001)

          工作液配制:將貯存液 1:100 稀釋于 RPMI 1640 或 PBS (無菌,無 Na3N),此時為 1μg/ml

          工作濃度:50 ng/ml

          細胞培養:每 100μl 培養體系中加入 5μl 工作液

          2. Ionomycin (Multisciences, 70-CS0002)

          工作液配制:貯存液 1:20 稀釋于 RPMI 1640 或 PBS (無菌,無 Na3N),此時為50μg/ml

          工作濃度:500 ng/ml

          細胞培養:每 100μl 培養體系中加入 1μl 工作液

          3. Monensin (Multisciences, 70-CS0004)

          工作濃度:2μM

          細胞培養:每 100μl 培養體系中加入 2.78μl 貯存液

          4. LPS

          工作濃度:10μg/ml
           

          二、樣本制備

          A. 淋巴細胞分離液分離法

          a. 外周血

          1. 采集至少 2ml 抗凝血,4 小時內使用

          2. 加入等量的緩沖液(如 PBS, pH 7.2-7.4)稀釋血液

          3. 取與稀釋后血液等體積的淋巴細胞分離液加入至離心管

          4. 將稀釋血液緩慢加入至淋巴細胞分離液上,保持兩者的界面清晰

          5. 室溫 300g 離心 20min

          6. 吸取單個核細胞層,轉移至新的離心管中,加入緩沖液,300 g 離心 10 min,棄上清后,再洗滌一次

          7. 棄上清,用細胞培養液重懸,臺盼藍染色計數活細胞(活細胞比例應大于 95%)

          8. 調整細胞濃度為 2×106 個/ml

          b. 脾臟

          1. 將脾臟切成小塊后,經 400 目銅網研磨,制成單細胞懸液

          2. 取與脾細胞懸液等體積的淋巴細胞分離液加入至離心管

          4. 將脾細胞懸液緩慢加入至淋巴細胞分離液上,保持兩者的界面清晰

          5. 室溫 300 g 離心 20min

          6. 吸取單個核細胞層,轉移至新的離心管中,加入緩沖液,300 g 離心 10 min,棄上清后,再洗滌一次

          7. 棄上清,用細胞培養液重懸,臺盼藍染色計數活細胞(活細胞比例應大于 95%)

          8. 調整細胞濃度為 2×106 個/ml

          B. 磁珠分選純化法(推薦,可選)

          以 CD19 MicroBeads, human (130-050-301)分選純化人 B 細胞[7]。或以 CD19 MicroBeads, mouse (Miltenyi, 130-052-201)或 CD45R (B220) MicroBeads, mouse (Miltenyi, 130-049-501)進行分離純化小鼠 B 細胞[5, 12, 13]。并以抗人 CD19 抗體或抗小鼠 CD19 抗體或抗小鼠 CD45R 抗體進行流式檢測。具體操作請參照說明書。

          三、細胞培養:

          淋巴細胞分離液分離的單個核細胞或磁珠分選純化的 B 細胞(1×106 個/ml)接種 于 細 胞 培 養 板 中 , 刺 激 組 加 入 LPS(10μg/ml) 、 PMA(50ng/ml)、 ionomycin (500ng/ml)和 monensin (2μM),37℃,5%CO2 恒溫細胞培養箱中孵育 5h。未刺激組不加 LPS,其余同。對于同時檢測 B10 和 B10 細胞祖細胞(B10Pro cell)的實驗,需培養 48h,使 B10Pro 細胞發育為成熟的 B 細胞,在最后 5h 再加入上述刺激劑和阻斷劑[14]。

          四、流式檢測(四色法)

          1. 細胞計數,取未刺激(A 管)和刺激(B 管)的細胞(2×105-2×108/管),加入適量(具體參照說明書)FcR 阻斷劑(Human Fc Receptor Binding Inhibitor Purified(人)或 Anti-Mouse CD16/CD32 Purified(小鼠)), 加入 Staining Buffer 補充至 100μl,冰上孵育 20min。

          2. 將 A 管和 B 管分別等分成 2 份,標為 A1(同型對照管)、A2(樣品管)、B1(同型對照管)、B2(樣品管)。

          3. 各管按下表加入相應的抗體(具體量請參照說明書):

          A. 人

          管號 抗體
          A1 Mouse IgG2b κ Isotype Control PE
          Mouse IgG2a κ Isotype Control PerCP-Cy5.5
          A2 Anti-Human CD19 FITC
          Anti-Human CD1d PE
          Anti-Human CD5 PerCP-Cy5.5
           
          管號
          抗體
          B1
          Mouse IgG2b κ Isotype Control PE
          Mouse IgG2a κ Isotype Control PerCP-Cy5.5
          B2
          Anti-Human CD19 FITC
          Anti-Human CD1d PE
          Anti-Human CD5 PerCP-Cy5.5

          B.小鼠

          管號
          抗體
          A1
          Rat IgG2b κ Isotype Control PE
          Rat IgG2a κ Isotype Control PerCP-Cy5.5
          A2
          Anti-Mouse CD19 FITC
          Anti-Mouse CD1d PE
          Anti-Mouse CD5 PerCP-Cy5.5
           
          管號
          抗體
          B1
          Rat IgG2b κ Isotype Control PE
          Rat IgG2a κ Isotype Control PerCP-Cy5.5
          B2
          Anti-Mouse CD19 FITC
          Anti-Mouse CD1d PE
          Anti-Mouse CD5 PerCP-Cy5.5

          每管加入 Staining Buffer 補充至 100μl,室溫避光孵育 15min。

          4. 每管加入 1-2ml Staining Buffer,300g 離心 5min,棄上清。

          5. 每管加入 100μl Fix&Perm 中的 Reagent A(即固定液),室溫避光孵育 15min。

          6. 每管加入 3ml Staining Buffer,300g 離心 5min,棄上清。

          7. 每管加入 100μl Fix&Perm 中的 Reagent B(即破膜和溶血液),同時各管按下表加入相應的抗體(具體量請參照說明書):

          A. 人

          管號
          抗體
          A1
          Rat IgG1 κ Isotype Control eFluor® 660
          A2
          Anti-Human IL-10 eFluor® 660
           
          管號
          抗體
          B1
          Rat IgG1 κ Isotype Control eFluor® 660
          B2
          Anti-Human IL-10 eFluor® 660


          B.小鼠

          管號
          抗體
          A11
          Rat IgG2b κ Isotype Control APC
          A22
          Anti-Mouse IL-10 APC
           
          管號
          抗體
          B1
          Rat IgG2b κIsotype Control APC
          B2
          Anti-Mouse IL-10 APC

          室溫避光孵育 15min。

          8. 每管加入 3ml Staining Buffer,300g 離心 5min,棄上清。

          9. 每管加入 0.5ml Staining Buffer,重懸細胞,上機檢測


          五、實驗結果示例

          圖 2 CD1dhiCD5+CD19+B 細胞是 B 細胞中分泌 IL-10 的主要亞群。野生型小鼠脾細胞在破膜前經 LPS、PMA、ionomycin 和 monensin 孵育 5h 后,用 CD19、CD1d、CD5 和 IL-10 單抗染色[15]。


          【參考文獻】


          1. Mizoguchi, A., et al., Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor alpha mutant mice. J Exp Med, 1997. 186(10): p. 1749-56.


          2. Fillatreau, S., et al., B cells regulate autoimmunity by provision of IL-10. Nat Immunol, 2002. 3(10): p. 944-50.


          3. Mizoguchi, A., et al., Chronic intestinal inflammatory condition generates IL-10-producing regulatory B cell subset characterized by CD1d upregulation. Immunity, 2002. 16(2): p. 219-30.


          4. Mauri, C., et al., Prevention of arthritis by interleukin 10-producing B cells. J Exp Med, 2003. 197(4): p. 489-501.


          5. Yanaba, K., et al., A regulatory B cell subset with a unique CD1dhiCD5+ phenotype controls T cell-dependent inflammatory responses. Immunity, 2008. 28(5): p. 639-50.


          6. Matsushita, T., et al., Regulatory B cells inhibit EAE initiation in mice while other B cells promote disease progression. J Clin Invest, 2008. 118(10): p. 3420-30.


          7. Mizoguchi, A. and A.K. Bhan, A case for regulatory B cells. J Immunol, 2006. 176(2): p. 705-10.


          8. Asseman, C., et al., An essential role for interleukin 10 in the function of regulatory T cells that inhibit intestinal inflammation. J Exp Med, 1999. 190(7): p. 995-1004.


          9. Grunig, G., et al., Interleukin-10 is a natural suppressor of cytokine production and inflammation in a murine model of allergic bronchopulmonary aspergillosis. J Exp Med, 1997. 185(6): p. 1089-99.


          10. Riley, J.K., et al., Interleukin-10 receptor signaling through the JAK-STAT pathway. , 1999. 274(23): p. 16513-21.


          11. Bettelli, E., et al., IL-10 is critical in the regulation of autoimmune encephalomyelitis as demonstrated by studies of IL-10- and IL-4-deficient and transgenic mice. J Immunol, 1998. 161(7): p. 3299-306.


          12. Matsushita, T., et al., Regulatory B cells (B10 cells) and regulatory T cells have independent roles in controlling experimental autoimmune encephalomyelitis initiation and late-phase immunopathogenesis. J Immunol, 2010. 185(4): p. 2240-52.


          13. Yanaba, K., et al., The development and function of regulatory B cells expressing IL-10 (B10 cells) requires antigen receptor diversity and TLR signals. J Immunol, 2009. 182(12): p. 7459-72.


          14. Iwata, Y., et al., Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood, 2011. 117(2): p. 530-41.


          15. Bouaziz, J.D., K. Yanaba, and T.F. Tedder, Regulatory B cells as inhibitors of immune responses and inflammation. Immunol Rev, 2008. 224: p. 201-14.

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