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          Th17 檢測原理和樣品處理方法

          作者:聯科生物    發布日期:2018-11-29 13:00

          我們通常所說的 Th1、Th2 和 Th17 是指 T 輔助細胞(嚴格意義上是 Th0 細胞)在各種生理與病理條件下分化為 Th1、Th2 和 Th17 的能力。靜息狀態(即未受任何刺激,如人的正常生理狀態)下,Th0 分化為 Th1、Th2 和 Th17 的能力非常弱,所以外周血中僅含有極少量的 Th1、Th2 和 Th17 細胞,這時我們所能檢測到的 IFN-γ、IL-4、IL-17A 也微乎其微。而當 Th 細胞受到外界因素,如刺激素,病原體等刺激,其中 Th0 即會向 Th1、Th2或 Th17 大量分化,具體分化趨向取決于細胞因子的種類。此時,我們檢測到的 IFN-γ、IL-4 或 IL-17A 也較多。實驗中我們檢測的 Th1、Th2 和 Th17 實際上是檢測 Th 細胞對刺激素刺激的反應能力。


          我們通常選用的刺激素為 PMA(佛波酯)+ Ionomycin(離子霉素)。


          其中 PMA 為 PKC(蛋白激酶 C)的激活物,PKC 則可激活下游眾多的蛋白激酶的磷酸化,形成級聯反應,導致許多蛋白的表達,進而引起 T 細胞的活化。在細胞內,PKC 可被 DAG(二脂酰甘油)和 Ca2+的共同作用而激活,因此在 Ionomycin(Ca2+的轉運劑,可將細胞器內的 Ca2+轉運至胞漿內)的參與下,T 細胞內 PKC 可被進一步激活。可見,PMA與 Ionomycin 協同活化 T 細胞。


          也有人選用其它刺激劑來活化 T 細胞,如 CD3/CD28 協同刺激,PHA 刺激等。實驗表明,PMA 為廣譜性刺激,即 T 細胞中的各亞群均會被 PMA 同等激活,而 CD3/CD28協同刺激和 PHA 刺激,則是通過 TCR 受體的作用,僅對部分 T 細胞亞群有效。所以可根據實驗的需要來選擇刺激方式。


          活化的 T 細胞可分泌多種細胞因子至細胞外,而流式細胞儀僅能檢測細胞內的抗原,所以應阻斷細胞因子分泌至細胞外。方法為破壞高爾基體(Golgi),因細胞因子(即各種蛋白)在合成后需經高爾基體的加工和轉運,才能到達細胞膜,然后通過高爾基體膜與細胞膜的融合作用將細胞因子分泌至細胞外。因此破壞高爾基體即可切斷細胞因子的轉運途徑,干擾其分泌。我們通常選用的阻斷劑為 BFA 或 Monensin, 其中 BFA 的阻斷效果優于 Monensin, 但由于前者價格較昂貴,現實驗中多用 Monensin 來替代 BFA.


          另外,實驗過程中涉及到如何正確的選定 Th(即 T 輔助細胞)的問題。 Th 細胞的表面標志為 CD3+CD4+,而當用 PMA 刺激 4 小時時,會發現 CD4+的細胞明顯減少,甚至消失,這是因為 PMA 會誘發細胞表面 CD4 分子被內吞。所以通常的做法是用 CD3 和 CD8反設 CD4 細胞,即 CD3+CD8-的細胞被認為是 CD3+CD4+的細胞。(注:PMA 對小鼠 CD4的影響很小,所以檢測小鼠 Th1/Th2/Th17 時可用 CD4 直接設門)。

          詳細實驗步驟:


          1. 標本采集及制備

          A. 血液標本

          用肝素抗凝管采集靜脈血(必須用肝素鈉抗凝, 不可用肝素鋰、EDTA 或枸櫞酸鈉) 1-2ml,血液室溫放置,8 小時內必須進行檢測,否則需棄用。

          B. PBMC(外周血單個核細胞)標本

          1) 肝素抗凝管采集靜脈血至少 2ml,采集后 4 小時內使用;

          2) 加入等體積的 HBSS(Hank 平衡鹽緩沖液,pH7.2-7.4)稀釋血液;

          3) 取與稀釋后血液等體積的淋巴細胞分層液(Ficoll 液)加入離心管中;

          4) 將稀釋血液小心地加到淋巴細胞分層液上,注意保持兩者界面清晰;

          5) 室溫下,2000 r/min,離心 20 分鐘;

          6) 用毛細吸管輕輕吸出單個核細胞層,加入含有 5ml HBSS 的試管中,充分混勻;

          7) 1500 r/min,離心 5 分鐘,棄上清后,再洗一次;

          8) 棄上清,用 RPMI 1640(含 10%熱滅活 FBS)重懸單個核細胞,用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在 95%以上);

          9) 調節細胞濃度為 2 x 106 細胞/ml


          2. 需要的試劑(以Multisciences Th17檢測試劑盒為例)

          Human——人Th17染色試劑盒/Human Th17 staining kit


           

          Mouse——小鼠Th17染色試劑盒/ Mouse Th17 staining kit


          3. 預實驗檢測刺激效果

          1) 全血標本:取 250ul 全血標本,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等體積稀釋到500ul;PBMC 標本:用 RPMI 1640(含 10%熱滅活 FBS)重懸單個核細胞,用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在95%以上);調節細胞濃度為 2 x 10^6 細胞/ml) ,取 500ul;

          2) 在標本中加入 250× PMA/Ionomycin (Multisciences #CS1001) 2ul,混勻

          3) 37℃,5% CO2 培養箱培養 4~6 小時,期間注意相隔 1~2 小時混勻一次

          4) 取 100ul 樣本,加入 Human CD3(或 Mouse CD4)和 CD69 PE(用量詳見說明書),室溫孵育 20 分鐘(全血樣本溶血)后,用流式染色緩沖液(Multisciences #S1001)洗一遍,300g 離心 5 分鐘,棄上清,用流式染色緩沖液重懸至 500ul,上機檢測

          5) CD3+(或 CD4+)細胞中,CD69 的陽性率應達到 90%以上,進行下一步正式實驗


          4. 正式實驗:

          1) 全血標本:取 250ul 全血標本,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等體積稀釋到500ul;PBMC 標本:用 RPMI 1640(含 10%熱滅活 FBS)重懸單個核細胞,用臺酚蘭染色計數活細胞數(應在95%以上);調節細胞濃度為 2 x 10^6 細胞/ml) ,取 500ul;

          2) 在標本中加入 250× PMA/Ionomycin (Multisciences #CS1001) 2ul 和 250×

          Monensin/BFA (Multisciences #CS1002) 2ul,混勻

          3) 37℃,5% CO2 培養箱培養 4~6 小時,期間注意相隔 1~2 小時混勻一次

          4) 檢測樣品管設置——Human

          管 1:CD3 FITC/CD8α PerCP-Cy5.5/Mouse IgG1 PE

          管 2:CD3 FITC/CD8α PerCP-Cy5.5/IL-17A PE

          檢測樣品管設置——Mouse

          管 1:CD3 FITC/CD4 PerCP-Cy5.5/Rat IgG2a PE

          管 2:CD3 FITC/CD4 PerCP-Cy5.5/IL-17A PE

          5) 每個樣品做 2 管,分別加入 100ul 培養好的細胞或者全血,以及表面抗體(HumanCD3、CD8 抗體或 Mouse CD4 抗體,用量見說明書),4℃避光孵育 30min,不用洗

          6) 加入 FIX&PERM Reagent A 100μl 室溫孵育 15min

          7) 加入 3ml 染色緩沖液(Multisciences #S1001),300g 離心 5min 棄上清收集細胞,液體盡量倒干凈,不要殘留

          8) 渦旋,加入 FIX&PERM Reagent B 100μl 和 IL-17A 抗體(同型對照管加入同等劑量的抗體),混勻,4 度孵育 30min

          9) 加入 3ml 染色緩沖液,300g 離心 5min 棄上清收集細胞

          10) 用 0.5ml PBS 重懸后立即上機,或者加入 0.1%多聚甲醛 0.5ml 避光 4℃保存24小時內上機分析

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