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          首頁 > 生物資訊 > 技術資料 > 小鼠 Treg 試劑盒操作步驟

          小鼠 Treg 試劑盒操作步驟

          作者:聯科生物    發布日期:2018-11-08 09:00


          1. 在每個流式上樣管中加入 100 µl 準備好的細胞懸液,細胞數約為 1x10^6 個。


          2. 按照細胞表面抗原染色方法標記表面抗原。按照說明書加入適量的 CD4 和 CD25 抗體。4 ℃孵育30 分鐘。


          3. 用預冷 PBS 洗滌細胞,離心去上清。


          4. 用 3 倍體積的固定/破膜稀釋液(#ICD01) 稀釋 固定/破膜濃縮液(#ICC01),制成固定/破膜工作液,注意要新鮮配制,每管的用量為 1ml。


          5. 旋渦震蕩重懸細胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液(1:3 稀釋好),并再次旋渦混勻。


          6. 避光 4℃孵育 30 分鐘。


          7. 將破膜緩沖液(#ICB01)用去離子水 1:9 稀釋,制成破膜緩沖液工作液。每管的用量為 8.5ml。


          8. 加入 2ml 破膜緩沖液工作液(1:9 去離子水稀釋),離心洗滌細胞并棄去上清液。


          9. (可選)用 100ul 破膜緩沖液工作液重懸細胞,加入 2µl Anti-Mouse CD16/CD32 (2.4G2), Purified(#AM016)進行阻斷,室溫避光孵育 15 分鐘。


          10. 無需洗滌,加入 Foxp3 抗體或 PE Rat lgG2a 同型對照(用破膜緩沖液工作液進行稀釋),避光 4℃孵育至少 30 分鐘。建議進行預實驗摸索出抗體的最適濃度。


          11. 加入 2ml 破膜工作液離心洗滌細胞并棄去上清液。


          12. 用適量體積的 Flow Cytometry Staining Buffer 重懸細胞,并上機檢測并分析。


          注:由于染色過程中使用了細胞固定和破膜,對比起活細胞在形態上會有一定變化,因此 FSC/SSC 圖中圈門時需要做一定調整。


          以上步驟僅供參考,以廠家說明書為準。

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