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          首頁 > 生物資訊 > 技術資料 > 抗體抗原實驗該如何選擇抗體?

          抗體抗原實驗該如何選擇抗體?

          作者:佚名    發布日期:2017-06-29 09:00

          檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇,為縮小抗體的選擇范圍選中合 適的抗體,

          需要考慮如下幾種因素:

          1. 分析或應用的類型

          2. 樣本蛋白的結構性質

          3. 樣本的種屬

          4. 抗體宿主的種類

          5. 抗體的標記和檢測


          一、分析試驗的應用類型

          一般抗體說明書都列出該抗體經試驗驗證過適用于何種分析類型,如:可以應用于WB IHC ICC ELISA 分析等,如果抗體說明書沒有提及的應用類型,并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型,而僅是說明尚未經過此種分析試驗驗證,如果抗體不適用某些分析試驗,則會在抗體說明書上標注出來不適于某分析試驗。


          二、 樣本蛋白的結構性質

          了解樣本蛋白的結構性質有助于選擇最合適的抗體,至少兩方面因素需要考慮:

          1. 待測樣本蛋白的結構域:抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來,其中的免疫原包括:全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機體(如:細菌)或細胞,抗體說明書一般都有免疫原的描述,如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區域,則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FACS 流式檢測活細胞的表面蛋白,則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。

          2. 樣本的提取或處理過程:某些抗體要求樣本經過某些特殊處理,例如:許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結構阻礙的蛋白樣本,另一方面,某些抗體僅識別天然折疊狀態的蛋白。當選擇免疫組化的抗體時,應注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織,而另一些抗體則適用于無需抗原修復解交聯步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織,這些都會在抗體說明書上應用部分標示出來。


          三、樣本的物種

          應選擇物種相同或有交叉反應的抗體,抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應,因其氨基酸序列同源性較高,如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應種屬表中,并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白,而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過,應通過序列比對的方法來預測交叉反應,可應用Expasy 和 NCBI BLAST 來進行不同物種蛋白同源性比對。


          四、一抗宿主物種的選擇

          一般說來,在使用偶聯二抗結合無偶聯物的一抗時,一抗宿主動物的物種選擇較為重要,對于免疫組化而言,盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗,從而避免二抗與樣本內源性免疫球蛋白產生交叉反應,例如:檢測小鼠樣本蛋白,則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗,最好選兔源的一抗,則二抗則可選擇偶聯了檢測分子(酶、熒光素、生物素等)的抗兔IgG。

          如果選擇有偶聯物的一抗則不適用上述情況,除免疫組化外的其它對不含內源性免疫球蛋白樣本的檢測方法,則抗體宿主物種的影響不大,如對不含IgG 的細胞裂解物樣本的western blotting檢測,盡管如此,含有血清的組織裂解物和組織培養上清中含有免疫球蛋白,還原變性樣本中含IgG,在western blot 檢測中則結合出現IgG 分子50 and 25 kDa 的重鏈和輕鏈條帶。


          五、 二抗的選擇

          二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源,例如:如果你的一抗是小鼠的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建議檢查二抗說明書確保該抗體適用于你的檢測應用, 二抗一般連接熒光素FITC 或發光團。


          六、雙重染色抗體的選擇

          用未偶聯一抗進行細胞培養物或組織切片的雙重免疫染色要求一抗來源于不同物種并且二抗分別識別其中之一,二抗說明書應描述其與其它物種來源的免疫球蛋有否有交叉吸附。


          七、熒光和化學發光標記

          連接于二抗的標記物是為了檢測抗體的結合,選擇標記物依賴于幾個參數:檢測方法:熒光或著色沉淀,熒光標記物用特殊波長的光激發時發射出可見光,下表列出了幾種熒光素的分子特征:

           
            熒光素
            顏色
            激發波
            發射波長
            分子量  
            Aminomethylcoumarin(AMCA)
            Blue
            353
            440
            410
            Fluoresein(FITC)
            Green
            495
            528
            390
            Fluorescein(DTAF)
            Green
            495
            528
            530
            Rhodamine(TRITC)
            Red
            550
            570
            444
            Texas Redtm
            Red
            596
            620
            625
            Cy2tm
            Green
            489
            505
            897
            Cy3tm
            Orange
            522
            565
            949
            Cy3.5tm
            Scarlet
            581
            596
            1286
            Cy5tm
            Far-Red
            650
            667
            975  
            Cy5.5tm
            Near Infra-Red
            678
            703
            1312
            Cy7tm
            Near Infra-Red
            743
            767 
            1001
            R-Phycoerythrin(RPE)
            Red
            488
            575
            240000
            B-Phycoerythrin(BPE)
            Red
            545
            575
            240000
            C-Phycocyanin
            Red
            618
            640
            110000
            R-Phycocyanin
            Red
            615
            620
            110000


          二抗連接標記酶HRP and AP 與其底物產生有顏色的沉淀物
           

          辣根過氧化物酶
          Horseradish peroxidase(HRP)
          堿性磷酸酶
          Alkaline phosphatase(AP)
          AEC(red)
          Fast red(pink)
          DAB(brown)
          INT(yellow/brown)
           
          NBT(brow/purple)
           
          New Fuchsin(red)
           
          TNBT(purple)
           
          Vega red(pink)


          封片介質(僅免疫組化),AEC、Fast Red、INT 或其它水性發光基團是可以醇溶的并要求水性封片。除上述之外的發光基團是有機的所以最好使用有機性封片介質。


          熒光素標記物要求水性封片介質,藻紅蛋白(藻青素 / 藻紅素要求不添加甘油的水性封片介質,因其有淬滅熒光的效應。


          生物素化的抗體通常用于加強親和素-生物素-酶或熒光素復合物(ABC 試劑 或親和素或鏈霉親和素連接酶或熒光素的信號)

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