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          MTT 實驗心得體會

          作者:丁香通    發布日期:2018-12-11 10:00


          實驗原理:

          MTT 法又稱 MTT 比色法,是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。在一定細胞數范圍內, MTT 結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、 細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。


          實驗步驟:

          1. 接種細胞:用含 10% 胎牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔合適的細胞數量接種到96孔板,每孔體積 180 ul。

          2. 培養細胞:同一般培養條件,可根據試驗目的和要求決定培養時間。

          3. 呈色:每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml 用 PBS 緩沖液 pH=7.4 配制)20 ul。繼續孵育 4 小時,終止培養,小心棄去孔內培養上清液,對于懸浮細胞,需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加 150ul DMSO,振蕩 10 分鐘,使結晶物充分融解。

          4. 比色:選擇 490 nm 波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果。


          影響實驗關鍵因素:

          1. 細胞消化。若消化出現問題,則會影響細胞的活性,進而影響 OD 值。對于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的細胞,消化時胰蛋白酶中不添加 EDTA,消化時也僅需胰酶浸潤數秒即可。然而,對于SW480等一系列難以消化的細胞,胰蛋白酶中需添加濃度為 0.25% 的 EDTA。

          2. 接種數量。對于細胞接種數量要適宜,過小或過大均會影響 OD 值(過小細胞容易死亡,過大細胞容易生長擁擠)。

          幾種常見細胞的每孔接種數量如下(個人經驗)

          3. 培養液的棄去。一般大家喜歡用移液器吸取孔內培養液,吸取的時候要注意移液頭要緊貼孔內側壁吸取,不要觸碰底部的紫色結晶。或者將96孔板倒扣于濾紙上來吸取孔內的培養液。兩種方法效果差不多,根據個人喜好選擇。

          4. 結晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后,將加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱內孵育 10~20 min,這樣有助于 DMSO對紫色結晶物的溶解(尤其在冬天)。


          聯科生物MTT試劑推薦:


          聯科生物MTT試劑提供了MTT Solvent和 Formazan Solvent,可直接使用Formazan Solvent溶解結晶物,無需自備DMSO溶液。


          使用過程中,若是貼壁細胞,棄去培養基,加入與初始體積等量的Formazan Solvent。非貼壁細胞,直接在培養基中加入與初始體積等量的溶解液。

           
          存貨編碼 存貨名稱 規格型號 目錄價
          70-MTT001 MTT細胞增殖檢測試劑盒 100assays 150
          70-MTT002 MTT細胞增殖檢測試劑盒 200assays 200
          70-MTT005 MTT細胞增殖檢測試劑盒 500assays 300
          70-MTT010 MTT細胞增殖檢測試劑盒 1000assays 500
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